W pierwszej połowie XIV wieku na południowych obrzeżach Preszowa wzniesiono budynek szpitala miejskiego, do którego w tym samym stuleciu dobudowano mniejszą kaplicę. W 1429 r. na jej miejscu wybudowano nowy kościół szpitalny pod wezwaniem Najświętszej Marii Panny. W jego sąsiedztwie znajdował się szpital i przytułek. Po reformacji kościół szpitalny stał się kościołem ewangelickim dla słowackiej ludności Preszowa. Po dekrecie władcy Leopolda I, w 1673 r. kościół został przekazany Minorytom, którzy przybyli do Preszowa w tym samym roku. Oprócz kościoła, Minoryci otrzymali również na własność szpital. W XVII wieku został on połączony z klasztorem minorytów, a w XVIII wieku został przebudowany w stylu barokowym do obecnej formy. W 1757 r. namalowano cztery większe freski z życia św. Jana Chrzciciela. Zachowały się one do dziś na suficie nawy głównej. Od 1818 r. kościół należał do biskupstwa greckokatolickiego. W północnej kaplicy, przed ołtarzem, znajduje się sarkofag ze szczątkami biskupa Petera Paula Gojdiča. Jego szczątki zostały umieszczone w sarkofagu po beatyfikacji w 2001 roku. Na północnej ścianie katedry, za szkłem, znajduje się kopia Całunu Turyńskiego, którą preszowska katedra otrzymała w prezencie od arcybiskupstwa Turynu we Włoszech w 2003 r. Jest to faksymile, które zostało wyprodukowane tylko w czterech egzemplarzach. W latach pięćdziesiątych XX wieku kościół został przekazany Kościołowi prawosławnemu, gdy w Czechosłowacji zlikwidowano Kościół greckokatolicki. Został jej zwrócony w 1968 roku, po przywróceniu Kościoła greckokatolickiego.
