V 1. polovici 14. storočia bola postavená na južnom okraji Prešova budova mestského špitála, ku ktorej bola ešte v tom istom storočí pristavená menšia kaplnka. Na jej mieste začali stavať roku 1429 nový špitálsky kostol, zasvätený Panne Márii. V jeho susedstve sa nachádzala nemocnica a chudobinec. Po nástupe reformácie sa špitálsky kostol stal evanjelickým kostolom slovenského obyvateľstva Prešova. Po nariadení panovníka Leopolda I. bol v roku 1673 kostol odovzdaný reholi minoritov, ktorí prišli do Prešova v tom istom roku. Okrem kostola minoriti dostali do vlastníctva aj nemocnicu – špitál. V 17. st. bol spojený s minoritským kláštorom a v 18. storočí barokovo prestavaný do súčasnej podoby. V roku 1757 vznikli štyri väčšie fresky zo života sv. Jána Krstiteľa. Dodnes sú zachované na strope chrámovej lode. Kostol patril od r. 1818 gréckokatolíckemu biskupstvu. V severnej kaplnke je pred oltárom umiestnený sarkofág s pozostatkami biskupa Petra Pavla Gojdiča. Jeho pozostatky do sarkofágu uložili po jeho blahorečení v roku 2001. Na severnej stene katedrály je za sklom upevnená kópia Turínskeho plátna, ktoré prešovská katedrála dostala ako dar od Turínskeho arcibiskupstva v Taliansku v roku 2003. Ide o faksimile, ktoré bolo vyrobené len v štyroch exemplároch. V 50. rokoch bol chrám daný do užívania pravoslávnej cirkvi, keď bola v Československu zrušená gréckokatolícka cirkev. Naspäť sa jej vrátil v r. 1968, po znovuobnovení gréckokatolíckej cirkvi.
